Дегрануляция базофилов

Тест дегрануляции базофилов

У больных аллергией значительная часть IgE связывается различными лейкоцитами через их Fc-рецепторы. Наличие клеток, несущих антитела, указывает на сенсибилизацию их к соответствующему аллергену. Базофилы крови и тучные клетки являются первичными эффекторными клетками в IgE-опосредованных аллергических реакциях немедленного типа, таких, как аллергический ринит, бронхиальная астма, крапивница и анафилактический шок. В острый период количество базофилов, нагруженных иммуноглобулинами, в крови снижается за счет перехода их в ткани, и обнаружить их труднее. Чаще они выявляются в период ремиссии.

Тесты, основанные на реакции базофилов в присутствии аллергена, основаны на прямом микроскопическом исследовании базофилов при специальном окрашивании клеток. При наличии сенсибилизации в присутствии специфического аллергена происходит повреждение (дегрануляция) базофилов больных. Морфологическими критериями дегрануляции являются активное движение гранул, окрашенных нейтральным красным или толуидиновым синим, внутри клетки; подвижность базофилов, нарушение формы клетки, выход гранул за пределы клетки и ее обесцвечивание.

Вариант 1. Для постановки реакции используют кровь, стабилизированную гепарином (10-15 мл). Отстаивают 30-40 минут. Плазму с лейкоцитами отбирают и центрифугируют 3-5 минут при 500 об/мин. Из полученного осадка лейкоцитов, обогащенного базофилами, без отмывания (во избежание дегрануляции) готовят суспензию клеток на забуференном физрастворе (5*10 6 клеток в 1 мл). На сухое предметное стекло, предварительно покрытое 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного (раствор красителя готовят, инкубируя его при 37 °С в течение суток), нанесят по 50 мкл лейкоцитарной суспензии и раствора аллергенa в нужной концентрации Раствор аллергена не должен вызывать дегрануляцию несенсибилизированных лейкоцитов. Его оптимальная концентрация предварительно подбирается. Для пыльцевых и бактериальных аллергенов она составляет от 10 до 100 PNU/мл, для антибиотиков 100-1000 Ед/мл, 0,01-0,1% для растворов химических аллергенов. Приготовленный препарат накрывают покровным стеклом, края которого смазаны вазелином. Аналогично готовятся контрольные пробы, куда вместо аллергена добавляют буферный раствор. После инкубации при 37°С
15 мин при микроскопии под иммерсией подсчитывают не менее 40 базофилов и определяют процентдегранулированных клеток. Реакция считается положительной, если в опытена 15% и более поврежденных клеток больше, чем в контроле.

Вариант 2. В лунки планшета вносят 50 мкл суспензии лейкоцитов, приготовленной на забуференном физрастворе из гепаринизированной крови и добавляют равный объем оттитрованного аллергена. В контрольной лунке вместо аллергена используется буферный раствор. Инкубируют лунки при 37°С 15 минут, после чего в каждую из них добавляют по 100 мкл 0,025%-ного раствора толуидинoвого синего (750 мг на 1 л 25%-ного раствора этанола, рН 3,5 доводят добавлением ледяной уксусной кислоты) и подсчитывают число окрашенных базофилов. Толуидиновый синий окрашивает гранулы базофилов. В контроле должно содержаться не менее 30 базофилов. Подсчет клеток проводят в камере Горяева. Можно использовать несколько камер, чтобы общее количество базофилов отвечало указанному условию. Реакция считается положительной, если число окрашенных клеток в опыте уменьшилось на 30% и более.

Тест дегрануляции базофилов в клинической практике не получил широкого распространения в связи с трудностью его постановки при небольшой концентрации клеток, обычно присутствующих в крови. По сравнению с микроскопическими методиками более прогрессивными являются цитометрические исследования.

Дата публикования: 2014-11-18 ; Прочитано: 1685 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org – Студопедия.Орг – 2014-2020 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.001 с) .

БАЗОФИЛЬНЫЙ ТЕСТ

Базофильный тест (греческий basis основа + philia склонность; синоним тест Шелли) — метод диагностики специфической сенсибилизации организма, основанный на дегрануляции базофилов после добавления к ним специфического аллергена (рис.). Предложен Шелли (W. В. Shelley) в 1962 году. В последующие годы базофильный тест использован различными исследователями для изучения пыльцевой, лекарственной и пищевой аллергии. Базофильный тест получил признание как дополнительный тест для диагностики аллергических заболеваний и как метод выявления аллергических антител человека. Базофильные лейкоциты крови подобно тканевым тучным клеткам принимают участие в освобождении гистамина, гепарина, медленно реагирующей субстанций и серотонина. Считают, что реакция дегрануляции базофилов крови свидетельствует о наличии реакции аллерген — антитело (см. Антиген-антитело реакция). Природа антител, обусловливающих реакцию дегрануляции, остается неясной. Наиболее вероятно, что это реагины (см. Антитела, аллергические).

Существует две разновидности базофильного теста: 1) прямой тест, при к-ром реакция дегрануляции воспроизводится на спонтанно сенсибилизированных базофилах больного (лейкоциты больного + аллерген); 2) непрямой тест, при котором реакция дегрануляции воспроизводится на базофилах кролика или здорового человека (лейкоциты + исследуемая сыворотка больного + аллерген); в реакции лучше использовать лейкоциты кролика, содержащие много базофилов (4—12%). Непрямой тест получил большее распространение.

Материалы, используемые для прямого базофильного теста: 1) свежая кровь больного; 2) аллерген, повышенную чувствительность к которому предполагается исследовать; 3) фиксирующий раствор (6 мл этанола, 2 мл хлороформа и 2 мл ацетона); 4) целлюлозные мембранные фильтры.

Методика прямого базофильного теста

Смешивают 0,25 мл гепаринизированной крови больного и 0,025 мл аллергена. Через 5 минут к 0,1 мл смеси добавляют охлажденный фиксирующий раствор, который разрушает эритроциты, оставляя интактными лейкоциты. После фиксации в течение ночи при t° 4° лейкоциты ресуспензируют и фильтруют через целлюлозные мембранные фильтры в течение 20 минут. При этом базофилы остаются на фильтрах. Фильтры окрашивают в течение 30 секунд раствором толуидинового синего, обезвоживают в этаноле и просветляют в ксилоле. Подсчитывают 20 базофилов. Их классифицируют по размеру, окраске, числу и локализации базофильных гранул. Для «истощенных» базофилов характерно: 1) небольшое количество гранул; 2) небольшие слабо окрашенные гранулы; 3) значительное количество гранул, расположенных за пределами клетки. Тест считается положительным, если «истощено» (дегранулирует) больше половины базофилов.

Материалы, используемые для непрямого базофильного теста: 1) свежая или сохраняемая при t°—20° сыворотка крови больного; 2) аллерген; 3) концентрированная взвесь лейкоцитов кролика, полученная при центрифугировании гепаринизированной крови со скоростью 3000 об/мин в течение 5 минут в тонких стеклянных пробирках или полиэтиленовых трубочках; 4) предметные стекла, окрашенные раствором нейтральрота. Для каждого аллергена опытным путем подбирают ту концентрацию, которая не вызывает неспецифических изменений базофилов.

Методика непрямого базофильного теста

На окрашенное нейтральротом предметное стекло наносят одинаковое количество (по 0,005 мл) лейкоцитарной взвеси, исследуемой сыворотки больного и аллергена. Предметное стекло накрывают покровным, края которого смазаны вазелином, и ставят на 10 минут в термостат (при 37°). Параллельно ставят контрольные пробы: 1) исследуемая сыворотка со взвесью лейкоцитов (чтобы исключить неспецифическую дегрануляцию); 2) взвесь лейкоцитов с аллергеном. Реакцию наблюдают под микроскопом с иммерсией. Считают не менее 20 базофилов. Основные признаки повреждения базофилов следующие: разбухание и потеря сферичности, гранулолизис, выход гранул из клеток. Полное разрушение клетки с выходом гранул в окружающую среду («взрывчатая» дегрануляция) наблюдается крайне редко.

Выделяют три степени реакции дегрануляции: 1) слабая реакция (+)— дегрануляция при базофильном тесте превышает таковую в контроле на 10%; 2) умеренная реакция (+ +) — превышение дегрануляции в контроле на 15%; 3) резко положительная (+ + +) — превышение дегрануляции в контроле на 20% и более. Критерием положительного базофильного теста можно считать исчезновение гранул более чем у 70% базофилов. Ценность представляют только четко положительные результаты, а отрицательные не исключают состояния повышенной чувствительности к данному аллергену.

Библиогр.: Ишимова Л. М. и 3еличенко Л. И. Аллергические реакции форменных элементов крови и их значение для диагностики, в кн.: Аллергич. заболевания у детей, под ред. М. Я. Студеникина и Т. С. Соколовой, с. 144, М., 1971; Польнер А. А. Реакция дегрануляции базофильных лейкоцитов при аллергии к растительной пыльце, Тер. арх., г. 40, № 2, с. 103, 1968; Shelley W. В. New serologicai test for allergy in man, Nature (Lond.), v. 195, p. 1181, 1962; он жe, Indirect basophil degranulation test for allergy to penicillin and other drugs, J. Amer. med. Ass., v. 184, p. 171, 1963.

Наши внутренние войска: базофилы и тучные клетки

Пост про эозинофилы лежит тут.

А сегодня осталось рассмотреть последних представителей из рода гранулоцитов.

Базофилы являются зернистыми лейкоцитами, и их доля от общего количества лейкоцитов – самая маленькая (около 0,5%). Норма базофилов в крови – до 1 % (ноль тоже является нормой). Эти клетки окрашиваются щелочными или основными (basis) красителями. В мазке они видны как пурпурно-черные клетки с большим количеством крупных гранул. Гранул так много, что сквозь них трудно увидеть дольчатые ядра. Основная часть базофилов циркулирует в крови от шести часов до суток, после чего выходит в ткани.

В базофильных зернах в большом количестве содержатся гистамин и гепарин, а также серотонин, пероксидаза и другие вещества, обеспечивающие воспалительную реакцию. Напомню, что гистамин вызывает расширение капилляров и увеличивает их проницаемость, также вызывает спазм гладких мышц, кожный зуд и увеличивает секрецию носовой и бронхиальной слизи. Спазм гладкой мускулатуры в кишечнике способствует развитию диареи или рвоты, спазм в бронхах – затруднению дышать. Гепарин замедляет свертываемость крови. Серотонин, как и гистамин, вызывает расширение капилляров и служит хемоаттрактантом для иммуных клеток. Пероксидаза ускоряет распад перекиси водорода до воды и атома кислорода, являющегося губительным для клеточных мембран.

Электронная микроскопия базофила. В центре – три крупных сегмента ядра. Черные пятна B и MF – это базофильные гранулы. Буква М обозначает митохондрии.

Кроме того, базофильные зерна содержат специальные вещества (хемотаксические факторы) для привлечения эозинофилов и нейтрофилов в очаг воспаления.

Фотография базофила в электронном микроскопе. В центре видно большое светло-синее ядро, вокруг – зеленоватые базофильные гранулы.

Двоюродные братья базофилов – тучные клетки. Ещё их называют лаброциты или мастоциты. Они чуть больше размером своих кузенов, но содержат точно такие же гранулы и выполняют схожие функции. Если базофилы созревают в костном мозге и выходят в кровь совершеннолетними, то тучные клетки выходят в кровь незрелыми. Они попадают в слизистые оболочки и соединительную ткань, где завершают созревание. Также мастоциты обладают меньшей подвижностью и живут гораздо дольше собратьев. Мастоциты в большом количестве представлены в покровных тканях: коже, кишечнике, легких.

Электронная фотография тучной клетки. По центру расположено ядро, вокруг – множество гранул

Базофилы и тучные клетки имеют на своей поверхности Tall-подобные рецепторы, рецепторы к комплементу, к антителам класса IgE и IgG, а также к различным цитокинам. При активации этих рецепторов базофилы и мастоциты реализуют свои биологические эффекты. Tall-подобные рецепторы реагируют на бактерии, грибы и некоторые вирусы. Антитела класса Ig E вырабатываются в связи с аллергическими реакциями и глистной инфекцией. Антитела класса IgG вырабатываются в связи со многими инфекциями (бактериальными, вирусными, грибковыми).

Базофилы и тучные клетки играют ключевую роль в развитии аллергий. Однако первоначальная функция тучных клеток, располагающихся на границе нашего организма и внешнего мира, это привлечение к месту опасности других иммунных клеток. Обилие лаброцитов в покровных тканях позволяет им оперативно реагировать на любые повреждения (инфекция, травмы, ожоги и т.д.) Как только произошло нарушение целостности тканей, лаброциты выделяют гранулы с гистамином и серотонином.

Процесс выхода веществ из гранул называется дегрануляцией. Дегрануляция тучных клеток усиливает локальный кровоток, в результате чего в очаг выходят другие иммунные клетки (нейтрофилы, эозинофилы, моноциты и макрофаги). Как выглядит дегрануляция под микроскопом посмотреть можно здесь. Физиологический смысл дегрануляции – обеспечить больший приток крови, создать отек и привлечь остальных участников иммунного процесса. Отек нужен для того, чтобы ограничить распространение патогена и не допустить его распространение в кровоток (кровь притекает, но не оттекает). Если базофилов (мастоцитов) много и они дегранулируют слишком быстро и активно, то развивается аллергия вплоть до анафилактического шока.

Базофилы и тучные клетки слабо способны к фагоцитозу, но могут секретировать антимикробные вещества. Они также способны к образованию внеклеточных ловушек – этозу (подробнее об этом в нейтрофилах).

Иллюстрация этоза тучной клетки.

А – тучная клетка “в покое”. B, C – тучная клетка образует внеклеточные ловушки в ответ на инфекцию пиогенным стрептококком. D – кокки “пойманы” в ловушку.

Кроме того, эффект гистамина привлекает эозинофилы и обеспечивает спазм гладких мышц кишечника. Белки, выделяемые эозинофилами, оказывают повреждающий эффект на личинки гельминтов, а также на эпителий кишечника. Эпителий отмирает и слущивается, вместе со спазмом кишечника этот механизм пытается изгнать глистов из просвета кишки. Антитела и комплемент также атакуют оболочку гельминтов вместе с активными формами кислорода, вырабатываемыми эозинофилами. Так что глистам тоже приходится несладко.

Ещё одна электронная фотография тучной клетки.

Вещества, блокирующие действие гистамина, называются антигистаминными. Они блокируют рецепторы гистамина, в результате чего гистамин не может связаться с родственными белками. К таким веществам относятся супрастин, диазолин, цетрин и многие другие.

Ещё есть лекарства, которые относятся к стабилизаторам мембран тучных клеток. Эти вещества предотвращают дегрануляцию тучных клеток, а значит, никакие вещества из лейкоцитарных зерен не попадут в ткани или в кровоток. Дегрануляция блокируется не только у тучных клеток и базофилов, но и у эозинофилов, нейтрофилов и макрофагов. К лекарствам этого класса относятся, например, недокромил или тайлед. Часто применяются в лечении бронхиальной астмы и других легочных заболеваний.

Повышенное количество базофилов называется базофилией. Оно возникает при аллергиях, бронхиальной астме, язвенном колите, некоторых аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, псориаз), а также при опухолевых заболеваниях крови (лейкозы, лимфомы). Также повышаться базофилы могут вследствие анемии, когда костный мозг в попытке компенсировать анемию усиленно синтезирует лейкоциты. Так как базофилы привлекают эозинофилы, то с большой долей вероятности при повышенных базофилах в крови будут повышены и эозинофилы.

Определить снижение базофилов в крови (базопения) практически невозможно, так как они быстро мигрируют из крови в ткань, и их отсутствие в крови нельзя рассматривать как нарушение.

В следующий раз расскажу о моноцитах. Всем хорошей весны и никаких аллергий!